Candesartan w PD: neuroprotekcja potwierdzona analizą proteomiczną

Czy antagoniści receptora angiotensyny mogą chronić neurony przed degeneracją w chorobie Parkinsona?

Choroba Parkinsona pozostaje jednym z najpoważniejszych wyzwań neurologicznych XXI wieku, a dotychczasowe terapie skupiają się głównie na łagodzeniu objawów, nie hamując postępu neurodegeneracji. Ostatnie lata przyniosły jednak fascynujące odkrycia wskazujące na potencjalną rolę układu renina-angiotensyna-aldosteron (RAA) w patogenezie PD. Badania na modelach zwierzęcych wykazały, że aktywacja receptorów angiotensyny typu 1 (AT1) zwiększa podatność neuronów dopaminergicznych na uszkodzenie, podczas gdy blokery receptora AT1 (ARB) – szczególnie te penetrujące barierę krew-mózg, takie jak candesartan – wykazują działanie neuroprotekcyjne.

Szczególnie istotne są dane z sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder komórkowych, które pokazują, że najbardziej wrażliwa populacja neuronów dopaminergicznych istoty czarnej wykazuje najwyższą ekspresję genu receptora AT1 (AGTR1). Co więcej, retrospektywne badania obserwacyjne u pacjentów z nadciśnieniem wykazały, że leczenie ARB wiąże się ze znaczącym zmniejszeniem ryzyka rozwoju PD, zwłaszcza przy stosowaniu leków penetrujących barierę krew-mózg przez dłuższy czas.

Mimo obiecujących wyników z badań przedklinicznych, do tej pory brakowało dowodów na neuroprotekcyjne działanie ARB bezpośrednio u pacjentów z PD. Wcześniejsze 28-tygodniowe randomizowane badanie kliniczne fazy II z candesartanem wykazało poprawę w zakresie apatii – wyniszczającego objawu niemoторycznego PD – jednak molekularne zmiany zachodzące w mózgu pozostawały niezbadane. Niniejsze badanie wypełnia tę lukę, wykorzystując innowacyjną metodę analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) izolowanych z krwi pacjentów.

Jak zbadano wpływ candesartanu na mózg pacjentów z chorobą Parkinsona?

Badanie objęło 5 pacjentów z PD (2 kobiety, 3 mężczyzn) uczestniczących w 28-tygodniowym, randomizowanym, podwójnie zaślepionym badaniu klinicznym fazy II. Pacjenci otrzymywali candesartan w dawce początkowej 4 mg/dobę przez pierwsze 4 tygodnie, następnie dawkę zwiększano do 8 mg/dobę do 24. tygodnia, po czym lek stopniowo odstawiano. Krew pobierano przed rozpoczęciem leczenia oraz po jego zakończeniu.

Kluczowym elementem metodyki była izolacja i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) – małych struktur uwalnianych przez komórki, które mogą przekraczać barierę krew-mózg i odzwierciedlają stan fizjologiczny komórek macierzystych. Z próbek krwi izolowano EV pochodzące z czterech typów komórek mózgowych: neuronów (nEV), astrocytów (aEV), oligodendrocytów (oEV) oraz mikrogleju/makrofagów (m/mEV). Wykorzystano w tym celu chromatografię wykluczania wielkości (SEC) oraz immunoizolację z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko specyficznym markerom powierzchniowym (L1CAM dla neuronów, GLAST dla astrocytów, MOG dla oligodendrocytów, TMEM119 dla mikrogleju).

Charakterystykę EV przeprowadzono za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), mikroskopii elektronowej transmisyjnej (TEM) oraz testów ELISA potwierdzających obecność kanonicznych markerów EV (CD81, CD63, Alix). Następnie wykonano ilościową analizę proteomiczną metodą SWATH-MS, identyfikując 1141 białek, z czego 874 poddano kwantyfikacji. Za dysregulowane uznano białka spełniające kryteria: log fold change (FC) ≥0,6 lub ≤-0,7 oraz p<0,05, z bardziej restrykcyjnym progiem p<0,01 dla najbardziej istotnych zmian.

Jakie zmiany proteomiczne zaobserwowano w neuronalnych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych?

Analiza proteomiczna neuronalnych EV (nEV) wykazała 46 dysregulowanych białek po leczeniu candesartanem: 19 uległo regulacji w górę, a 27 w dół. Najważniejszym odkryciem była istotna statystycznie (p<0,01) regulacja w górę białka PARK7/DJ-1 – kluczowego czynnika antyoksydacyjnego i sensora stresu mitochondrialnego. Mutacje w genie PARK7 są przyczyną autosomalnych recesywnych form PD, co podkreśla jego fundamentalną rolę w ochronie neuronów. Białko to łagodzi akumulację reaktywnych form tlenu (ROS), chroni integralność mitochondriów oraz moduluje autofagię i kontrolę jakości białek.

Inne białka regulowane w górę (p<0,01) obejmowały: TCPZ (podjednostkę kompleksu chaperonowego CCT/TRiC, który hamuje agregację α-synukleiny), RL21 (białko rybosomalne wskazujące na zwiększoną syntezę białek), CAYP1 (sugerujące przywrócenie transportu wewnątrzkomórkowego), FUS (zaangażowane w metabolizm RNA, naprawę DNA i utrzymanie synaps) oraz H1X (mogące odzwierciedlać przebudowę chromatyny w odpowiedzi na leczenie).

Równolegle zaobserwowano istotną statystycznie (p<0,01) regulację w dół szeregu białek związanych ze stresem komórkowym. Obniżenie poziomu HSP90B1 (GRP94/gp96), głównego chaperonu retikulum endoplazmatycznego, wskazuje na zmniejszony stres ER w neuronach macierzystych. Downregulacja szlaku ADF/kofilina, obejmującego destrinę (DEST), odzwierciedla zakończenie procesów przebudowy aksonalnej i synaptycznej. System ADF/kofilina promuje patogenność i rozprzestrzenianie się α-synukleiny, a jego nadaktywność nasila fenotyp parkinsonowski – zatem jego redukcja może być korzystna.

Zmniejszenie ekspresji LANC1 (transferazy glutationowej) sugeruje obniżenie stresu proteotoksycznego i oksydacyjnego, niższe poziomy PLCD1 wskazują na stabilizację architektury cytoszkieletu i sygnalizacji wapniowej, a spadek NRCAM może odzwierciedlać zakończenie przebudowy aksonalnej. Redukcja PUR2 implikuje normalizację metabolizmu puryn, a obniżenie AMPL (metalopeptyazy zależnej od Zn²⁺ zaangażowanej w degradację koniugatów S-glutationowych) dodatkowo wspiera tezę o zmniejszonym stresie oksydacyjnym.

Czy candesartan wpływa na funkcje astrocytów w chorobie Parkinsona?

Analiza astrocytarnych EV (aEV) wykazała 22 dysregulowane białka (10 regulowanych w górę, 12 w dół), co sugeruje przejście astrocytów w kierunku fenotypu wspierającego neurony i mniej reaktywnego. Wśród białek regulowanych w górę (p<0,01) wyróżniały się: PSB4 (podjednostka katalityczna proteasomu 20S, wskazująca na wzmocnioną proteostazę), LSAMP (białko błony limbicznej zaangażowane w tworzenie synaps i łączność neuronalną), PHLD (mogące promować usuwanie toksycznych białek zakotwiczonych w GPI) oraz SYFB (odzwierciedlające poprawę funkcji mitochondriów).

Jednocześnie zaobserwowano regulację w dół (p<0,01) białek związanych ze stresem: SUMO2 (modyfikatora aktywnego w warunkach stresu oksydacyjnego i proteotoksycznego, który konjuguje źle sfałdowane białka jak α-synukleina), RS26L (białka podjednostki rybosomalnej 40S, którego redukcja sugeruje normalizację aktywności translacyjnej) oraz CRNS1 (enzymu degradującego antyoksydacyjny dipeptyd karnozynę, którego obniżenie może wskazywać na zachowaną zdolność antyoksydacyjną).

Te zmiany sugerują, że candesartan wzmacnia wsparcie astrocytarne dla neuronów przy jednoczesnym zmniejszeniu odpowiedzi stresowych, tworząc neuroprotekcyjne środowisko w PD. Analiza GO wykazała wzbogacenie procesów związanych z metabolizmem związków organoazotowych, co odzwierciedla rolę astrocytów w oczyszczaniu neuroprzekaźników, syntezie glutaminy i detoksyfikacji amoniaku.

Jaki wpływ ma candesartan na oligodendrocyty i mielinizację?

Analiza oligodendrocytarnych EV (oEV) wykazała najbardziej rozległe zmiany proteomiczne spośród wszystkich badanych typów komórek – 92 dysregulowane białka (55 regulowanych w górę, 37 w dół). Wzrost ekspresji (p<0,01) STXBP1 i L1CAM wskazuje na wzmocnioną komunikację synaptyczną i akson-glej. Oba białka są kluczowymi regulatorami fuzji pęcherzyków i adhezji komórkowej, a ich zwiększenie prawdopodobnie odzwierciedla adaptacyjną odpowiedź oligodendrocytów promującą integralność mieliny, wsparcie metaboliczne i łączność neuronalną.

Regulacja w górę TBCB i DBNL sugeruje wzmocnioną organizację cytoszkieletu i przebudowę komórkową – procesy związane z regeneracją oligodendrocytów i naprawą mieliny. TBCB wspiera montaż i stabilność mikrotubul, niezbędnych dla morfologii oligodendrocytów, różnicowania i transportu wewnątrzkomórkowego wymaganego do produkcji mieliny. DBNL reguluje przebudowę aktyny, kluczową dla rozszerzania się i dynamiki błon oligodendrocytów podczas mielinizacji.

Wzrost ekspresji APOC3, NP1L1 i SORCN wspiera metabolizm lipidów, neurogenezę i homeostazę wapnia. PPIA, DHX9 i PCBP1 zaangażowane w przetwarzanie RNA, kontrolę jakości białek i odpowiedzi na stres komórkowy, wspierają proteostazę i redukują tworzenie toksycznych agregatów. ATP5H i CPSM przyczyniają się do funkcji mitochondriów i detoksyfikacji amoniaku, zwiększając efektywność metaboliczną.

Z drugiej strony, regulacja w dół (p<0,01) KLKB1 (proteazy aktywującej układ kalikreina-kinina) jest zgodna z osłabionym stanem zapalnym i zmniejszonym zakłóceniem bariery krew-mózg. Zmniejszenie ekspresji CLIC4 (wewnątrzkomórkowego kanału chlorkowego) może wskazywać na poprawę kliniczną w PD, gdyż wzrost CLIC4 był związany z procesami neurozapalnymi i demielinizacyjnymi. Niższe poziomy ENO2 w oEV prawdopodobnie odzwierciedlają bardziej stabilny i dojrzały stan oligodendrogleju, zgodny z poprawą utrzymania mieliny i wsparcia neuronalnego.

Jak candesartan moduluje funkcje mikrogleju i odpowiedź immunologiczną?

Analiza EV pochodzących z mikrogleju/makrofagów (m/mEV) wykazała 48 dysregulowanych białek (23 regulowane w górę, 25 w dół), sugerując przejście w kierunku fenotypu naprawczego i neuroprotekcyjnego. Zwiększona ekspresja (p<0,01) NSF1C (p47) i PPP1R7 (SDS22) jest szczególnie istotna, gdyż oba białka działają jako negatywne regulatory sygnalizacji prozapalnej. NSFL1C/p47 wiąże łańcuchy poliubikwityny na NEMO (IKKγ), promując jego degradację lizosomową i tym samym hamując aktywację IKK/NF-κB. PPP1R7/SDS22, podjednostka celująca fosfatazy białkowej-1 (PP1), kieruje PP1 w stronę defosforylacji węzłów AKT/NF-κB, tłumiąc transkrypcję zapalną.

Wyższe poziomy RAB14 sugerują regenerację transportu endosomalnego-autofagicznego, procesu coraz częściej rozpoznawanego jako kluczowego w neurodegeneracji i stresie endolizosomowym związanym z PD. Wykrycie SNAP25 w mikroglejowych EV może wskazywać na wzmożone oczyszczanie i przebudowę materiału synaptycznego, zgodne z mikroglejowym przycinaniem i utrzymaniem synaps w warunkach stresu związanego z chorobą.

Jednocześnie zaobserwowano regulację w dół (p<0,01) białek związanych ze stresem mikroglejowym: ODO1 (którego downregulacja jest zgodna z obniżonym tonem mitochondrialnym-zapalnym w mikrogleju), PCP4 (mogącego wskazywać na stłumioną sygnalizację wapń/kalmodulina związaną z reaktywnością mikrogleju), PDIA6 (wskazującą na złagodzenie stresu ER) oraz HSP72 (którego zmniejszenie w ładunku m/mEV prawdopodobnie odzwierciedla osłabienie stresu mikroglejowego i aktywacji zapalnej, wraz ze zmniejszonym uwalnianiem prozapalnych DAMP do środowiska zewnątrzkomórkowego).

Analiza sieci interakcji białko-białko oraz wzbogacenie GO ujawniły znaczącą modulację procesów biologicznych związanych z wiązaniem glikozaminoglikanów i kwasu hialuronowego, kluczowych dla przebudowy macierzy pozakomórkowej, sygnalizacji immunologicznej i neuroprotekcji.

Co te odkrycia oznaczają dla przyszłego leczenia choroby Parkinsona?

Wyniki niniejszego badania dostarczają pierwszych dowodów na molekularne efekty neuroprotekcyjne antagonistów receptora AT1 bezpośrednio u pacjentów z chorobą Parkinsona. Candesartan indukował skoordynowane zmiany proteomiczne we wszystkich badanych typach komórek mózgowych – neuronach, astrocytach, oligodendrocytach i mikrogleju – wpływając na kluczowe mechanizmy degeneracji dopaminergicznej: stres oksydacyjny, dysfunkcję mitochondriów, proteostazę, neuroinflammację oraz integralność synaptyczną i mielinową.

Szczególnie istotne jest, że obserwowane zmiany są zgodne z licznymi wcześniejszymi badaniami na modelach zwierzęcych i hodowlach komórkowych PD, które wykazywały neuroprotekcyjne działanie ARB poprzez przeciwdziałanie głównym mechanizmom degeneracji neuronów dopaminergicznych. W modelach gryzoni i pierwotnych hodowlach mezencefalicznych ARB takie jak candesartan i telmisartan redukowały śmierć neuronów dopaminergicznych indukowaną neurotoksynami (6-OHDA, MPTP) lub nadekspresją α-synukleiny poprzez hamowanie stresu oksydacyjnego pochodzącego z oksydazy NADPH i mikroglejowej odpowiedzi neuroinflammacyjnej.

Mimo ograniczeń związanych z małą liczebnością grupy badanej (n=5) i stosunkowo krótkim okresem leczenia (28 tygodni), niniejsza analiza proteomiczna demonstruje niezwykłe efekty neuroprotekcyjne ARB penetrujących barierę krew-mózg na neurony i komórki glejowe pacjentów z PD. Co więcej, zastosowana metodyka izolacji i analizy EV pochodzących z różnych typów komórek mózgowych stanowi bezprecedensowe narzędzie do uzyskiwania informacji o procesach zachodzących w mózgu podczas procesów patologicznych oraz monitorowania efektów potencjalnych terapii neuroprotekcyjnych.

Przyszłe badania wykorzystujące różne metodologie skoncentrowane na najistotniejszych białkach/celach zidentyfikowanych w niniejszej pracy proteomicznej mogą potwierdzić i rozszerzyć obecne wyniki. Przede wszystkim jednak nasze rezultaty wskazują na pilną potrzebę przeprowadzenia większych badań klinicznych z wykorzystaniem ARB lub innych leków modyfikujących układ RAA jako wczesnej strategii terapeutycznej neuroprotekcji przeciwko postępowi choroby Parkinsona.

Czy analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych może zrewolucjonizować badania nad neurodegeneracją?

Niniejsze badanie po raz pierwszy wykazuje, że doustne podawanie candesartanu – antagonisty receptora angiotensyny AT1 penetrującego barierę krew-mózg – indukuje korzystne zmiany molekularne w neuronach i komórkach glejowych pacjentów z chorobą Parkinsona. Analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z krwi ujawniła dysregulację 46 białek w neuronalnych EV, 22 w astrocytarnych, 92 w oligodendrocytarnych oraz 48 w mikroglejowych/makrofagowych EV. Zmiany te obejmowały kluczowe mechanizmy neuroprotekcyjne: redukcję stresu oksydacyjnego i ER, poprawę funkcji mitochondriów, wzmocnienie proteostazy, stabilizację synaps oraz modulację neuroinflammacji.

Zastosowana minimalnie inwazyjna metodologia izolacji i analizy EV pochodzących z różnych typów komórek OUN z próbek krwi obwodowej może stanowić przełom w badaniach i monitorowaniu klinicznym zaburzeń neurodegeneracyjnych. Umożliwia ona bezpośrednią ocenę molekularnych efektów terapii w konkretnych typach komórek mózgowych bez konieczności inwazyjnych procedur. Wyniki te, choć uzyskane na niewielkiej grupie pacjentów, dostarczają pierwszych dowodów eksperymentalnych wspierających inicjowanie większych badań klinicznych nad repurposingiem ARB jako strategii neuroprotekcyjnej we wczesnych stadiach choroby Parkinsona.

Zgodność obserwowanych zmian proteomicznych z efektami neuroprotekcyjnymi ARB wykazanymi w licznych badaniach przedklinicznych wzmacnia specyficzność i znaczenie kliniczne niniejszych odkryć. Przyszłe badania powinny skupić się na walidacji tych wyników w większych grupach pacjentów, dłuższych okresach obserwacji oraz ocenie wpływu na progresję kliniczną choroby. Candesartan i inne ARB penetrujące barierę krew-mózg mogą stanowić obiecującą, łatwo dostępną i dobrze tolerowaną opcję terapeutyczną w neuroprotekcji przeciwko postępowi choroby Parkinsona.