Candesartan normalizuje naczynia nowotworowe i wzmacnia terapię

Sieć naczyniowa guza charakteryzuje się rozszerzeniem, kręceniem i dezorganizacją. Niedojrzały rozwój naczyń oraz brak odpowiedniego powiązania z pericytami prowadzą do nadmiernej przepuszczalności, słabej perfuzji i nasilonej hipoksji. Te warunki aktywują czynnik indukowany hipoksją (HIF-1) i napędzają nadekspresję genów proangiogennych, takich jak VEGF i FGF, jednocześnie znacząco redukując produkcję czynników hamujących angiogenezę. W konsekwencji proces angiogenezy zostaje przesunięty w stronę stanu proangiogennego, sprzyjając nieprawidłowej angiogenezie.

Terapia antyangiogenna (AAT) została początkowo opracowana jako monoterapia mająca na celu “zagłodzenie” guza. Jednak wczesne badania kliniczne wykazały, że bewacyzumab – przeciwciało przeciwko VEGF – nie poprawia przeżywalności w monoterapii. Ponadto kliniczne zastosowanie sunitinibu może powodować toksyczność związaną z leczeniem, taką jak mielosupresja, nadciśnienie i nieprawidłowa czynność wątroby. W 2001 roku Jain zaproponował koncepcję “normalizacji naczyń nowotworowych”. Od tego czasu coraz więcej dowodów sugeruje, że regulacja normalizacji naczyń nowotworowych może wywierać efekty hamujące nowotwór. Na przykład DLL1 indukuje normalizację naczyń nowotworowych, charakteryzującą się utrzymującą się poprawą perfuzji naczyniowej i zmniejszoną hipoksją w mikrośrodowisku guza.

APLNR (APJ) jest receptorem sprzężonym z białkiem G, którego endogennymi ligandami są APLN (Apelin) i ELA (ELABELA). Receptor ten jest szeroko ekspresjonowany w kardiomiocytach, adipocytach, komórkach neuronalnych i komórkach śródbłonka. W komórkach śródbłonka naczyniowych oś APLN/APLNR promuje proliferację komórek śródbłonka i dojrzewanie naczyń, wywierając znaczące efekty ochronne naczyń. Obniżone poziomy APLN w osoczu są związane z nadciśnieniem samoistnym i dysfunkcją lewej komory. Te odkrycia podkreślają kluczową rolę szlaku sygnałowego APLN/APLNR w utrzymaniu homeostazy sercowo-naczyniowej. Co więcej, badania wykazują, że APLNR służy jako wskaźnik angiogenezy w raku jelita grubego i zmniejsza angiogenezę nowotworową w raku płuc i piersi, co pozycjonuje APLNR jako potencjalny cel terapii przeciwnowotworowej naczyniowej.

Inhibitory celujące w oś APLN/APLNR można podzielić na trzy typy: przeciwciała, peptydy i chemiczne inhibitory małocząsteczkowe. Amodiaquine, selektywny małocząsteczkowy antagonista APLNR zidentyfikowany poprzez przesiewanie wysokoprzepustowe, hamuje sygnalizację APLN/APLNR w sposób zależny od stężenia. Jednakże liczba dostępnych inhibitorów jest ograniczona, a ich rola w normalizacji naczyń nowotworowych nie jest w pełni wyjaśniona. Niniejsze badanie miało na celu odkrycie nowych inhibitorów APLNR, zbadanie ich roli w normalizacji naczyń nowotworowych oraz ocenę ich potencjału w terapii kombinowanej z istniejącymi terapiami przeciwnowotworowymi.

Jak zidentyfikowano candesartan jako inhibitor APLNR?

Badacze zastosowali strategię drug repurposing – przesiewanie wirtualne biblioteki leków zatwierdzonych przez FDA w celu odkrycia substancji o funkcji modulującej normalizację naczyń nowotworowych poprzez antagonizowanie APLNR. Symulacje dokowania molekularnego przeprowadzono na 2509 lekach względem rozwiązanej struktury białka APLNR, oceniając powinowactwo wiązania w celu wyłonienia 21 najlepszych kandydatów. Związki te zostały następnie ocenione pod kątem aktywności hamującej APLNR przy stężeniu 2 µM przy użyciu testu FLIPR Calcium 6 Assay Kit, który kwantyfikuje mobilizację wapnia wewnątrzkomórkowego indukowaną ligandem.

Wyniki pokazały, że 8 związków kandydujących (A-2, A-3, A-4, A-6, A-7, A-9, A-11 i A-15) wykazało znaczące wskaźniki hamowania (od 48,1% do 72,3%), wskazując na ich potencjał jako silnych inhibitorów APLNR. Związki te zostały następnie ocenione pod kątem ich wpływu na regulację normalizacji naczyń in vivo przy użyciu modelu ryby danio (zebrafish). Model ten został wybrany ze względu na przezroczystość optyczną, umożliwiającą wizualizację naczyń in vivo, oraz znaczące podobieństwa naczyń siatkówkowych z architekturą naczyniową człowieka.

Najpierw 8 związków kandydujących przeszło wstępną ocenę toksyczności na zarodkach ryby danio. Zdrowe zarodki zebrafisha zebrano i umieszczono w 24-studzienkowych płytkach z gęstością 20 zarodków na studzienkę. Po 12 godzinach po zapłodnieniu (hpf) medium hodowlane zastąpiono świeżo przygotowanym medium zawierającym stopniowane stężenia każdego związku testowego. Po 48 hpf określono liczbę żywych zarodków i ustalono dawkę śmiertelną 50 (LD₅₀) dla każdego związku. F13A, dostępny komercyjnie antagonista APLNR, służył jako kontrola pozytywna.

Jakie są dowody na wiązanie candesartanu z APLNR?

Aby scharakteryzować interakcje molekularne między candesartanem a APLNR, przeprowadzono symulacje dokowania molekularnego przy użyciu struktury krystalicznej APLNR (PDB: 7SUS) jako szablonu. Candesartan zajmuje ortosteryczną kieszeń wiążącą APLNR, tworząc wiązania wodorowe z Lys268 i Arg168, jednocześnie ustanawiając interakcje π-π z Tyr271 i Phe291. Te obserwacje strukturalne sugerują wiązanie o wysokim powinowactwie do miejsca aktywnego receptora.

Wcześniejsze badania ustaliły, że aktywacja APLNR przez jego endogenny agonistę Apelin-13 hamuje sygnalizację białka Gi, tym samym osłabiając akumulację cAMP indukowaną przez forskolinę. Wykorzystując linię komórkową z nadekspresją APLNR (HEK293T-APLNR) i testy kwantyfikacji cAMP, potwierdzono, że stymulacja komórek HEK293T-APLNR forskoliną (20 µM) znacząco podnosiła poziomy cAMP, podczas gdy Apelin-13 (0,1 µM) skutecznie odwracał ten efekt. Co więcej, candesartan kompetycyjnie hamował mobilizację cAMP mediowaną przez Apelin-13. Wyniki wykazały, że leczenie candesartanem (10⁻⁴-100 µM) przywracało akumulację cAMP w sposób zależny od dawki, wykazując porównywalną skuteczność do referencyjnego antagonisty APLNR F13A.

Uzupełniające testy przepływu wapnia przy użyciu systemu FLIPR ujawniły, że zarówno candesartan, jak i F13A kompetycyjnie hamowały mobilizację wapnia mediowaną przez Apelin-13. Analiza ilościowa dała wartości IC₅₀ dla obu związków (candesartan: 1,214 µM; F13A: 1,174 µM), wskazując na znaczącą aktywność antagonistyczną APLNR. Aby dalej przeanalizować zdolność wiązania candesartanu z APLNR, przeprowadzono analizę rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) w celu określenia powinowactwa wiązania. Jednostki odpowiedzi (RU) wzrastały znacząco wraz ze wzrostem stężenia candesartanu od 0,390625 µM do 12,5 µM. Stała dysocjacji równowagowej (KD) obliczona na podstawie danych SPR wynosiła 1,715 µM.

Jak candesartan aktywuje szlak STING w komórkach śródbłonka?

Wcześniejsze badania wykazały, że szlak sygnałowy STING odgrywa kluczową rolę w modulowaniu przebudowy naczyń i normalizacji naczyń nowotworowych. Mechanizm obejmuje regulację w górę zarówno genów związanych z interferonem, jak i genów stabilności naczyniowej, co poprawia normalizację naczyń w tkankach nowotworowych. W oparciu o te dowody badacze zbadali, czy candesartan moduluje normalizację naczyń poprzez aktywację szlaku sygnałowego cGAS/STING.

Po pierwsze, zbadano ekspresję kluczowych białek w szlaku sygnałowym STING. Leczenie HUVEC candesartanem przez 48 godzin mogło indukować regulację w górę składników sygnalizacyjnych STING w sposób zależny od dawki, w tym stosunków fosforylacji TBK1 (p-TBK1/TBK1) i IRF3 (p-IRF3/IRF3). Te obserwacje wskazywały, że candesartan aktywował szlak sygnałowy STING. Ponadto aktywacja szlaku STING jest zazwyczaj związana z akumulacją cytozolowego dwuniciowego DNA (dsDNA). Po wykryciu dsDNA przez syntazę cyklicznego GMP-AMP (cGAS) kaskada sygnalizacyjna cGAS-STING jest inicjowana.

Biorąc pod uwagę powyższe wyniki, dalej zbadano, czy candesartan aktywuje szlak STING poprzez indukcję odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Analiza Western blot ujawniła wzrost ekspresji γ-H2AX w sposób zależny od dawki – dobrze ustalonego biomarkera podwójnych pęknięć nici DNA (DSB). Zgodnie z tymi odkryciami wyniki testu kometowego potwierdziły zwiększoną fragmentację DNA po ekspozycji na candesartan. Ponadto reaktywne formy tlenu (ROS) są naturalnymi produktami ubocznymi metabolizmu komórkowego. Ze względu na ich wysoce reaktywny charakter ROS mogą uszkadzać DNA, białka i lipidy.

Istniejące badania potwierdziły, że oś APLN-APLNR zwiększa generację ROS w śródbłonku, komórkach mięśni gładkich naczyń i ludzkich komórkach dróg żółciowych. Zatem zbadano wpływ candesartanu na produkcję ROS w komórkach HUVEC metodą cytometrii przepływowej. Poziomy ROS stopniowo wzrastały wraz ze wzrostem stężenia leku. Biorąc pod uwagę, że wysokie poziomy ROS mogą indukować apoptozę w warunkach nierównowagi redoks, zbadano wpływ candesartanu na apoptozę komórek HUVEC za pomocą cytometrii przepływowej. Wyniki wykazały, że nie zaobserwowano apoptozy w komórkach HUVEC po leczeniu candesartanem.

Jakie efekty wywiera candesartan na komórki śródbłonka in vitro?

Efekty antyproliferacyjne candesartanu na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) oceniono za pomocą testu sulforodaminy B (SRB). HUVEC traktowano stopniowanymi stężeniami candesartanu przez 48 i 72 godziny, uzyskując wartości IC₅₀ odpowiednio 32,4 ± 1,69 µM i 27,12 ± 0,91 µM. Co istotne, candesartan w stężeniu 15 µM nie wykazywał znaczącej cytotoksyczności na komórkach HUVEC, dlatego dawki niecytotoksyczne (15, 7,5 i 3,75 µM) zostały następnie zastosowane w dalszych badaniach normalizacji naczyń.

Angiogeneza jest procesem wieloetapowym wymagającym skoordynowanych funkcji śródbłonka, takich jak migracja komórek, proliferacja i przebudowa macierzy pozakomórkowej. W projekcie eksperymentalnym sunitinib, antagonista VEGF, został uwzględniony jako kontrola pozytywna. Następnie przeprowadzono testy gojenia ran i transwell w celu oceny hamującego wpływu candesartanu na migrację komórek HUVEC. Wyniki wskazały, że zarówno candesartan, jak i sunitinib znacząco zmniejszyły zdolności migracyjne i inwazyjne HUVEC, przy czym candesartan wywierał wyraźny hamujący efekt zależny od dawki.

Ponadto aktywacja sygnalizacji FAK-MMP9 jest znacząco skorelowana z potencjałem migracyjnym i inwazyjnym komórek śródbłonka i jest dalej zaangażowana w przerzuty nowotworowe. Eksperymenty Western blot ujawniły, że zarówno candesartan, jak i sunitinib znacząco zmniejszyły ekspresję MMP9 i FAK w HUVEC. Co więcej, w późniejszych etapach angiogenezy komórki śródbłonka naczyniowe ulegają proliferacji i migracji, a następnie ustawiają się w struktury przypominające sznury i światło naczynia.

Przeprowadzono test tworzenia rurek naczyniowych w celu oceny wpływu candesartanu na normalizację naczyń. Zarówno candesartan, jak i sunitinib znacząco zmniejszyły liczbę połączeń, całkowitą długość segmentów i liczbę oczek. Wyniki te wskazywały, że candesartan może hamować zdolność komórek śródbłonka do tworzenia rurek in vitro. Warto zauważyć, że zarówno candesartan, jak i sunitinib mogły zwiększyć średnie oczko i całkowity obszar oczek małych rurek. Podsumowując, powyższe wyniki wykazały, że candesartan hamował migrację, inwazję i tworzenie rurek komórek śródbłonka w dawkach niecytotoksycznych, sugerując jego zdolność do hamowania angiogenezy i promowania normalizacji naczyń.

Jak candesartan wpływa na normalizację naczyń nowotworowych in vivo?

Na podstawie odkryć in vitro ustanowiono model raka piersi u myszy w celu oceny potencjału candesartanu w modulowaniu normalizacji naczyń w tkankach nowotworowych. Neowaskularyzacja nowotworowa jest patologicznie odmienna od normalnych naczyń, wykazując charakterystyczną niedojrzałość, która przejawia się głównie jako niedobór pokrycia pericytami. Aby ilościowo ocenić dojrzewanie naczyń, przeprowadzono podwójne barwienie immunofluorescencyjne dla markera komórek śródbłonka CD31 i markera pericytów α-SMA w tkankach nowotworowych.

Ilościowa analiza obrazu ujawniła znaczący wzrost pokrycia pericytów α-SMA⁺ na komórkach śródbłonka CD31⁺ w grupach leczonych candesartanem (10 mg/kg i 30 mg/kg, i.p.) w porównaniu z kontrolami otrzymującymi pojazd, wskazując na znaczną poprawę integralności ściany naczyniowej i dojrzewania. Ponadto perfuzja naczyniowa wskazuje na ich funkcję transmisyjną, która jest kluczowa dla dostarczania środków chemioterapeutycznych i immunosupresyjnych.

Aby ocenić wpływ candesartanu na funkcję perfuzji naczyniowej guza, lektynę pomidorową znakowaną DyLight 649 (40 mg/kg), która specyficznie znakuje perfundowane naczynia krwionośne, wstrzyknięto myszom przez żyłę ogonową 1,5 godziny przed poświęceniem. Następnie wykonano sekcje mrożone tkanki nowotworowej, mikronaczynia oznakowano CD31 za pomocą immunofluorescencji i obserwowano oraz obliczono procent współekspresji lektyny pomidorowej i CD31⁺. Tylko niewielka frakcja naczyń CD31⁺ w grupie kontrolnej była pokryta lektyną pomidorową, z niskim odsetkiem CD31⁺Lectin⁺. W przeciwieństwie do tego procent CD31⁺Lectin⁺ był znacząco zwiększony w grupach leczonych candesartanem (10 mg/kg i 30 mg/kg), sugerując poprawioną funkcję perfuzji naczyniowej guza.

Ponadto hipoksja jest powszechną cechą mikrośrodowiska guza, przy czym czynniki indukowane hipoksją (HIF), szczególnie HIF-1α, odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnej odpowiedzi na niskie poziomy tlenu, promując angiogenezę i przerzuty. Wyniki wykazały znaczący spadek ekspresji HIF-1α w tkankach nowotworowych z grupy candesartanu. Dodatkowo barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) sekcji nowotworowych ujawniło zmniejszone obszary martwicze w guzach leczonych candesartanem w małej dawce (10 mg/kg), podczas gdy grupa z wysoką dawką (30 mg/kg) wykazała tendencję do zwiększonej martwicy, co było prawdopodobnie spowodowane nadmiernym przycinaniem naczyń i nasiloną hipoksją guza.

Podsumowując, candesartan nie tylko promuje normalizację struktury naczyniowej i poprawia funkcję naczyniową guza, ale także łagodzi hipoksję guza. Znaczące efekty terapeutyczne zaobserwowano w grupie z małą dawką, co wykazuje, że candesartan może indukować normalizację naczyń nowotworowych in vivo.

Czy kombinacja candesartanu z sunitinibem poprawia efekty przeciwnowotworowe?

Sunitinib, inhibitor VEGFR, może hamować angiogenezę. Jednak stosowany klinicznie w leczeniu przeciwnowotworowym może powodować kompensacyjną promocję angiogenezy, skutkującą nieprawidłowymi i nieuporządkowanymi naczyniami krwionośnymi guza oraz wyciekiem naczyniowym, ostatecznie prowadząc do niekorzystnej sytuacji, jaką są przerzuty nowotworowe. Biorąc pod uwagę wcześniejsze odkrycia, że candesartan ma potencjał do indukowania normalizacji naczyń, dalej zbadano, czy kombinacja z candesartanem może wzmocnić efekt przeciwnowotworowy sunitinibu.

Model raka piersi u myszy wykorzystano do zbadania efektów przeciwnowotworowych candesartanu i sunitinibu in vivo. Myszy BABL/c losowo podzielono na cztery grupy: pojazd, leczone candesartanem (10 mg/kg), leczone sunitinibem (40 mg/kg) i grupa kombinacji. W porównaniu z grupą pojazdu zarówno candesartan, jak i sunitinib mogły znacząco zmniejszyć wzrost guza. Co istotne, grupa leczona kombinacją wykazała najznaczniejsze hamowanie wzrostu guza. Każda grupa leczenia nie miała znaczącego wpływu na masę ciała myszy. Ponadto leczenie kombinowane również znacząco zmniejszyło liczbę guzków na powierzchni płuc, prawdopodobnie z powodu promowania normalizacji naczyń nowotworowych przez candesartan i hamowania przerzutów raka piersi do płuc.

Co więcej, zgłaszano, że sunitinib przejściowo podwyższa enzymy wątrobowe, prowadząc do śmiertelnej ostrej niewydolności wątroby. Hepatotoksyczność jest potencjalnie śmiertelnym efektem ubocznym leczenia sunitinibem, charakteryzującym się martwicą hepatocytów i zapaleniem. W tym badaniu zaobserwowano, że wątroby myszy leczonych sunitinibem wykazywały oczywiste uszkodzenie wątroby. Analiza histopatologiczna ujawniła, że po leczeniu sunitinibem hepatocyty wykazywały plamistą martwicę, pyknotyczne i rozdrobnione jądra, rozpuszczanie cytoplazmy, a pozaszpikowa hematopoeza była widoczna w lokalnych zatokach wątrobowych. Natomiast leczenie candesartanem w połączeniu z sunitinibem mogło znacząco poprawić uszkodzenie wątroby.

Ponadto użyto techniki wieloimmunofluorescencji do zbadania normalizacji naczyń nowotworowych po leczeniu lekiem. Wyniki ujawniły, że w grupie leczonej candesartanem i grupie kombinacji struktura naczyniowa staje się bardziej znormalizowana, a pokrycie pericytami komórek śródbłonka znacząco wzrosło. Co istotne, grupa kombinacji wykazała wyższy wzrost pokrycia pericytami niż grupy z pojedynczym lekiem, wskazując, że terapia kombinowana mogła lepiej promować dojrzewanie i normalizację naczyń guza.

Podsumowując, kombinacja candesartanu z sunitinibem znacząco wzmocniła skuteczność przeciwnowotworową i zmniejszyła przerzuty do płuc. Ten efekt może być przypisany zdolności candesartanu do promowania normalizacji naczyń nowotworowych, tym samym poprawiając wyniki terapeutyczne sunitinibu. Co ważne, candesartan łagodził hepatotoksyczność indukowaną przez sunitinib, sugerując jego potencjał jako terapii adjuwantowej w celu poprawy zarówno skuteczności, jak i bezpieczeństwa w leczeniu raka.

Czy candesartan może znaleźć zastosowanie w terapii nowotorów?

Badanie identyfikuje klinicznie dostępny lek candesartan jako silny induktor normalizacji naczyń nowotworowych i wykazuje jego synergiczną skuteczność z sunitinibem. Korzystny profil bezpieczeństwa candesartanu sugeruje, że jego kombinacja z sunitinibem może być klinicznie zarządzalna. Candesartan jest blokerem receptora angiotensyny II, klinicznie stosowanym w leczeniu pierwotnego nadciśnienia i posiadającym dobrze udokumentowany profil bezpieczeństwa w użyciu klinicznym przez ponad 22 lata. Badanie sugeruje, że może on być obiecujący do repurposingu w terapii nowotworów, szczególnie dla pacjentów onkologicznych z ryzykiem nadciśnienia. Zdolność candesartanu do normalizacji naczyń nowotworowych przy jednoczesnym utrzymaniu jego właściwości przeciwnadciśnieniowych pozycjonuje go jako potencjalnie wartościowego kandydata do terapii kombinowanej z sunitinibem. Wyniki wskazują nowy kierunek dla rozwoju nowych antagonistów APLNR i dostarczają również efektywnej strategii terapii nowotworów poprzez łączenie antagonistów APLNR z sunitinibem lub podobnymi środkami antyangiogennymi. Należy jednak pamiętać, że wyniki opierają się na modelach przedklinicznych, a skuteczność i bezpieczeństwo kombinacji candesartan-sunitinib nie zostały jeszcze ocenione w badaniach klinicznych.